汝 昆
主任医师，研究员。擅长血液病理的疑难病例诊断，目前致力于人工智能在血液病的精准诊断方面的研究。承担国家级和省市级课题及人才项目11项；国内外期刊发表学术论文100余篇；参编7部血液学专著；主导和参与制定11项血液病诊疗中国专家共识/指南；中国认可委医学专委会委员、国家药监局医疗器械分类技术委员会委员、中国生物医学工程协会人工智能分会血液病辅助决策标准化学组组长、人工智能医疗器械标准化技术归口单位专家组专家、中国老年医学会病理学分会副会长、中国抗癌协会血液肿瘤专委会常委兼血液病理工作组组长、天津市医学会病理学分会主任委员、天津医师协会检验医师分会副会长等；担任美国临床病理杂志、北美医学杂志、中华病理学杂志、中华血液学杂志、临床与实验病理学杂志、白血病淋巴瘤等杂志编委。
二代测序（Next-generation sequencing，NGS）技术从诞生到现在，虽然只有短短十几年的时间，但是其应用范围已经深入到了从基础科研到临床的各个领域。然而在具体实践中，由于缺乏统一的行业标准，在检测基因设计、实验操作、基因突变描述、生物信息分析、结果解读等方面依然存在不规范。中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会、中华医学会血液学分会、中华医学会病理学分会组织制定的《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识（2018年版）》[1]（以下简称《共识》），从NGS应用最为成熟的基因突变检测角度出发，围绕“为什么做”、“怎么做”及“如何做好”三个方面，对NGS在血液肿瘤中的应用给出了指导性的意见。一
为什么血液肿瘤患者需要进行NGS检测？
任何一项新的生物技术之所以能够在临床快速发展，都和临床需求紧密相关。随着血液肿瘤发病机制研究的不断深入，基因突变在疾病发生发展过程中的作用逐渐被证实，其中具有明确临床意义的突变基因已经被纳入了国际分类或诊疗指南中[2,3]。而NGS凭借高通量、高灵敏度、可定量和成本低的优势，在基因突变检测方面有着不可替代的作用。因此，正如《共识》所提及，NGS在血液肿瘤的诊断分型、预后判定、治疗指导、微小残留病（MRD）监测和克隆演变方面都具有重要的应用价值。
1.血液肿瘤诊断分型：从最新WHO分类中新增的以基因突变命名的亚型可以看出，基因突变检测已经成为血液肿瘤诊断的必要手段。急性髓系白血病伴重现性遗传学异常、遗传易感性髓系肿瘤、骨髓增殖性肿瘤、骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼细胞、毛细胞白血病和淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症中存在一些特异性的突变基因，这些突变基因的检测是其诊断的主要标准之一。在其它血液肿瘤的诊断中，突变基因的检测同样可以起到辅助诊断的作用[1]。
2.预后判定：随着基因组学研究的深入，越来越多的突变基因被纳入到血液肿瘤的预后分层体系。而且大多数血液肿瘤患者往往会同时发生多种基因突变，单一基因突变的检测已不足以精准地指导临床预后，多种基因突变的联合分析已成为近年的研究热点，所以NGS的高通量特点优势显著。
3.治疗指导：血液肿瘤是一类异质性很强的肿瘤，对患者遗传背景的全面分析是实现个体化治疗的前提。通过突变基因的检测，可以选择相应的靶向药物，同时对传统药物的敏感性进行评估。
4.微小残留病（MRD）监测：血液肿瘤MRD监测的分子指标主要包括融合基因、异常表达基因及基因突变。目前，流式细胞学（FCM）和RQ-PCR依然是MRD主流的监测方法，RQ-PCR灵敏度较FCM高，可达10-5，但每次反应仅能检测一个基因片段，适用于明确的分子异常，主要作为融合基因、常见类型比如NPM1突变以及WT1表达等指标的MRD监测手段。相比之下，NGS能够同时检测多个突变基因、突变位点及突变类型，对复发时不具有先前的突变或出现新突变的患者，NGS多靶点意义尤为突出，而且NGS通过提高检测深度可进一步提高灵敏度。
5.克隆演变：基因突变是肿瘤细胞克隆演变的基础和前提，在克隆演变的过程中，血液肿瘤会发生基因突变负荷的改变、新突变基因的出现或者原有突变基因的丢失，这种复杂的基因改变是传统的PCR或Sanger测序无法检测到的，而NGS可一次检测到所有的基因变异，有效识别亚克隆。通过NGS分析克隆演变，有助于了解血液肿瘤的分子发病机制、耐药机制，预测疾病的发展，并为治疗提供新的靶点[4-7]。
二
怎么做NGS？
《共识》对NGS检测的基因列表设计、整体实验流程、生物信息分析及最终的报告规范和解读进行了完整的介绍。
1.如何设计基因检测列表？首先，应充分考虑基因列表的临床适用性。由于实验室检测最终要服务于临床诊疗，因此设计基因列表要从临床诊疗的实际需求出发，由血液和实验室专家共同制定；其次，检测基因的筛选应考虑临床意义的重要性；检测基因的数量应在满足临床需求的基础上，综合样本数量、检测平台以及检测成本达到最优化的设计；检测的基因种类也应需随着临床诊疗的研究进展定期更新；最后，选择检测区域时，对于引物/探针覆盖不到的重要区域，或者大片段插入/缺失、碱基不平衡（连续碱基、高GC片段）等NGS效果差的基因片段，例如，FLT3-ITD、CEBPA、NPM1等基因，需要通过PCR和Sanger测序等方法补充检测，避免出现假阴性。
2.实验流程中有哪些注意事项？（1）骨髓、外周血或组织样本均可检测，但是脱钙样品不能用于NGS检测，已染色的组织标本不推荐进行NGS检测。无论是何种样本，首先都要确保样本中含有足够数量的肿瘤细胞。一般情况下，建议NGS检测的组织样本中肿瘤细胞含量达到20%以上[8]，否则应富集肿瘤细胞或增加测序深度，避免假阴性结果。此外，为了准确区分胚系突变与体细胞突变，建议同时送检患者正常组织作为胚系突变对照。（2）DNA提取后，要对DNA进行浓度、纯度和完整性的评估，尤其是石蜡组织样本；同时设立明确的合格样本标准，通常A260/280 应介于1.6-2.2，A260/230 应介于1.6-3.0，DNA浓度建议不少于20ng/ul。（3）文库制备时，多标本同时测序应明确不同的检测标本和分子标签的对应关系。各实验室应依据测序平台及测序策略建立最低的合格文库量，文库浓度过高或过低会导致测序数据量减少文库片段。文库片段小会导致测序数据量少，片段大导致测序质量下降及拼接错误率增加。
3.如何进行生物信息学分析？对NGS产生的原始数据需要经过质控分析、数据过滤、序列比对、突变位点的识别和注释以及突变位点的筛选一系列生物信息分析。《共识》对每个步骤的生物信息处理进行了详尽的介绍，并列举了分析过程中常用到的软件和参考数据库，实验室需要提前选择合适的软件，并设定好相应的分析参数和质控指标，保证数据分析的准确性。突变位点筛选环节虽然大部分实验室已实现自动化，但必要时还应进行人工核对，尽可能排除假阳性和假阴性位点。筛选时主要考虑变异位点的测序深度、reads数、变异等位基因频率、碱基比对质量值等指标，同时参考变异位置、变异类型、功能预测数据库、人群数据库及疾病数据库等。
此外，为了准确识别肿瘤的体细胞突变，建议同时检测患者的正常组织（口腔黏膜或毛囊等）作为胚系突变对照。若无法实现，实验室可参考变异等位基因频率、dbSNP、人群数据库、实验室自建数据库等，尽可能区分体细胞突变和胚系突变。
4.结果报告和解读：如何把经过生物信息学分析后的检测数据完整准确地转换为医学信息，是NGS临床应用面临的挑战之一。《共识》从报告的基本信息、突变位点的描述和分级报告，以及如何进行报告解读等方面进行了细致阐述。
实验室应尽可能的将检测结果以全面、客观、简明、易懂的方式呈现给临床医生及患者，为此应注意：1）报告内容的解读需由具备临床医学（尤其是血液学）及分子遗传学专业背景的人员共同参与，以满足临床应用的特殊要求；2）在对突变位点详细解读之前，建议根据患者情况进行总结性的说明，以方便临床医生从报告中迅速获取关键信息；对于多次送检的患者，尤其需要注意结合以往检测结果和临床信息进行综合分析；3）推荐根据突变位点的临床意义进行分级报告，分为具有明确临床意义的突变、具有潜在临床意义的突变、临床意义未明的突变。新发现的良性或可能良性变异不建议列在报告中。突变位点的描述信息应尽可能全面，如物理坐标、变异频率、测序深度等；4）报告中应描述突变位点在临床诊断、预后评估和治疗中的意义，并提供数据库或参考文献等支持依据，同时应特别注意数据库及参考文献的适用性，避免检测结果的过度解读；5）阴性结果不完全代表不存在突变，应注意排除由于灵敏度或检测区域局限性等技术原因所导致的假阴性；6）随着研究的进展，某些基因的临床意义等信息可能会更新，如有特殊需求时可考虑补充报告内容[9]。
三
如何做好NGS？
完善的质量控制体系是保证检测结果及时准确的前提。总体来讲，NGS的质量控制和其它分子生物学检测相似。首先应满足《分子病理诊断实验室建设指南（试行）》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》等分子生物学检测行业的通用要求。同时鉴于NGS方法的复杂性，分析前、分析中、分析后的各个环节都应设立严格的专业化的室内质控标准，并对有可能影响到检测结果准确性的各个因素进行评估和规定，包括人员、仪器、试剂、环境、检测方法等。同时还应定期参加室间质评项目或实验室间比对。
四
结语
NGS自身的优势决定了其广泛的应用前景，但同时技术的复杂性也决定了应用中会面临各类挑战。相信随着科学技术的进一步发展，相关管理监督机制的日臻完善，NGS的临床实践将会越来越规范化，也将在疾病的临床诊疗中发挥越来越重要的作用。
参考文献略
注：本文来源于《临床实验室》2020年第5期“肿瘤及伴随诊断”专题