导读
非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常见的慢性肝病之一，被认为与饮食和肠道菌群失调有关。三氯蔗糖是一种有机氯人工甜味剂，它被越来越多地添加到日常食用的食品中，如软饮料、谷类食品和无糖甜点。然而，越来越多的证据表明，过量的三氯蔗糖可引起肠道菌群失调，对宿主健康产生不利影响。而母体的饮食决定了新生儿的微生物群落，这种影响在子代的生活中还会继续。本研究旨在探讨母体摄入三氯蔗糖（maternal sucralose，MS）对子代成年期肝脂肪变性易感性的影响。
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文献ID
英文题目：Maternal sucralose intake alters gut microbiota of offspring and exacerbateshepatic steatosis in adulthood
中文题目：母体摄入三氯蔗糖会改变子代肠道菌群，并加剧成年期肝脂肪变性
发表期刊：《Gut Microbes》IF：7.823
发表时间：2020/3/31
通讯作者：王邦茂、曹海龙
通讯单位：天津医科大学总医院
材料与方法
将C57BL/6孕鼠随机分为MS组（妊娠期和哺乳期摄入MS）和母系对照组（MC组）。断奶后，所有的幼仔在8周龄之前都以标准饮食喂养，然后用高脂饮食（HFD）喂养4周。对3周龄的幼鼠进行肠道发育、粘膜屏障功能和肠道菌群的检测。此外，在第12周评估肝脂肪变性的严重程度、血清生化、脂质代谢和肠道微生物组成等。
图1a 实验流程图
研究成果
1、MS抑制3周龄幼鼠的肠道发育，破坏肠道屏障
在本研究中，幼鼠的性别比例和总产仔数在MS组和MC组之间没有显著差异，且两组均未发现死亡。除MS组子代在2~4周龄时体重明显高于MC组外，其余8周龄测定时间点两组子代体重基本一致。但在HFD 15天后，MS组子代体重明显高于MC组。因此，补充MS可轻微增加断奶期子代体重，显著加重HFD幼鼠的体重（图1b）。
在小鼠出生后第三周之前，胃肠道的发育主要受母体营养的影响。本文研究了三氯蔗糖对3周龄幼鼠肠道发育和肠道屏障完整性的影响。MS组3周龄幼鼠的绒毛长度和隐窝深度明显小于MC组（图1c-d）。与MC组比较，MS组Ki67阳性增殖细胞数减少（图2a）。同时，高碘酸希夫（PAS）阳性细胞（杯状细胞）数量也减少（图2b）。MUC2是杯状细胞最重要的产物之一，与黏液层的形成密切相关。根据MUC2阳性细胞的数量和mRNA的表达，与MC组相比，MUC2的表达量下调（图2c-d）。紧密连接蛋白包括ZO-1、Claudin-1、Claudin-3和Occludin被认为是决定肠道屏障完整性的最重要因素。PCR数据显示，MS组Claudin-1、Claudin-3、ZO-1表达明显降低，Occludin表达与MS组相似（图3a）。此外，免疫荧光也提示MS组中ZO-1蛋白表达下降（图3b）。免疫球蛋白A（IgA）在肠道免疫屏障功能中起着关键作用，可以抑制病原体的粘附。IgA免疫荧光显示，MS可显著降低IgA在小肠的表达水平（图3c-d），提示MS可抑制幼鼠早期肠道发育，破坏肠道屏障的完整性。
通过HE染色发现，两组幼鼠小肠和结肠没有明显的炎症反应（图1c）。进一步评估促炎细胞因子的水平，包括IL-1β，IFN-γ和结肠组织TNF-α。发现MS 组中这些促炎细胞因子mRNA 表达水平明显高于MC组（图2e）。结果表明，摄入MS可引起子代肠道轻度炎症，损伤肠道屏障功能。
图1b-d 母鼠摄入三氯蔗糖抑制了3周龄幼鼠的肠道发育
图2 母鼠摄入三氯蔗糖扰乱幼鼠肠道增殖和分化，并诱发3周龄幼鼠结肠轻度炎症
图3 母鼠摄入三氯蔗糖破坏幼鼠结肠的紧密连接，并使3周龄幼鼠小肠IgA减少
2、MS改变了3周龄幼鼠肠道微生物组成
通过16s rRNA测序对3周龄子代肠道菌群组成和结构进行分析。Venn图显示，MC组共356个OTU，MS组共281个OTU，两组共同拥有268个OTU（图4a）。分析两组的微生物群落结构发现，门水平优势物种分别是厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）。MS组疣微菌门和变形菌门的相对丰度随着拟杆菌门的减少而升高。在属水平，MS组与MC组之间存在显著差异的属主要有：Akkermansia、Alistipes、Barnesiella、Blautia、棒状杆菌属（Corynebacterium）、Paraprevotella、Robinsoniella、Saccharibacteria_genera_inc-ertaesedis、链球菌属（Streptococcus）。与MC相比，MS组 Akkermansia、Blautia、棒状杆菌属和Robinsoniella显著增加；同时，Alistipes、Barnesiella、Paraprevotella、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis和链球菌属减少（图4b）。
通过Shannon和Simpson多样性指数评估3周龄幼鼠的微生物alpha多样性。MS显著降低了alpha多样性（图4c）。通过主坐标（PCoA）分析和Adonis检验对非加权 UniFrac 距离进行计算，计算两组样本间的差异。结果表明，MS对3周龄幼鼠的微生物组成有显著影响（图4d）。
图4 母体摄入三氯蔗糖改变了3周龄幼鼠肠道微生物组成
通过LEFSe差异分析两组细菌在门、纲、目、科、属水平上的丰度差异（图5a）。差异物种丰度热图如图5b所示。其中MS组抗炎相关的Alistipes相对丰度较低。Parabacteroides（一种能调节宿主代谢、减轻肥胖和代谢功能障碍的菌属），在MS组中显著降低。而与肥胖和代谢紊乱高度相关的Blautia在MS组中显著升高。此外，在MS组中，疣微菌门的Akkermansia（一种降解黏液的菌）相对丰度增加，这可能是由于3周龄子代黏膜屏障功能的破坏和炎症反应的增加。与MS组肠道轻度炎症增加相一致，埃希氏杆菌属（Escherichia）/志贺氏杆菌（Shigella）和Anaerostipes在炎症性肠病和代谢紊乱中更为丰富的菌，在MS组中增加。链球菌和瘤胃球菌在MS组中减少，以往的研究中发现，这两种菌与炎症呈负相关。此外， MS 组产丁酸盐细菌Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）和Clostridium XlVa显著减少。这些结果表明，在孕期和哺乳期摄入MS可扰乱子代的肠道微生物组成。
图5 母鼠摄入三氯蔗糖改变了3周龄幼鼠体内关键细菌和SCFAs的产生
3、MS降低了3周龄幼鼠盲肠内短链脂肪酸(SCFAs)含量
碳水化合物细菌发酵可产生醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐等肠道SCFAs。已有研究报道肠道屏障功能与肠道SCFAs浓度呈正相关。在本研究中，MS组的丁酸盐产量明显低于MC组，乙酸和丙酸盐产量也有下降的趋势（图5c）。上述发现以及上述微生物组成的变化提示，产生SCFAs的细菌数量的减少和丁酸盐产量的下降可能与MS摄入导致肠道发育的抑制和肠道屏障的破坏有关。
4、MS加重了HFD诱导的成年小鼠肝脂肪变性
越来越多的研究表明，早期肠道微生物失衡和慢性炎症可能与成年期的不良后果有关。本文研究了早期摄入MS是否会增加成年期肝脂肪变性的风险。总的来说，MS组肝脏颜色为淡黄色，而MC组肝脏颜色为暗红色（图6a）。MS组肝脏及腹部脂肪组织重量较MC组明显增加（图6b）。与MC组相比，MS 组丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶显著增加 。此外，MS组血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平明显升高（图6c）。
HE染色证实，两组12周龄幼鼠均有明显的脂肪肝。MS组脂肪变性较严重，炎性细胞大量浸润，出现部分片状坏死。同时，MS组NAFLD活性评分(NAS)也显著高于MC组（图6d）。MS组肝脏的炎性细胞因子IL- 6和TNF-α等也升高（图6e）。
与MC组相比，MS组Fasn、Acaca等脂肪酸合成基因表达水平升高，胆汁酸合成限制酶Cyp7a1基因被抑制，肝脏中调节胆汁酸合成的关键基因shp显著上调（图6f）。这些基因表达的改变提示了MS干扰脂肪酸和胆汁酸的生物合成和代谢。
图6 母体摄入三氯蔗糖会加重12周龄幼鼠HFD诱导的肝脂肪变性
5、HFD加重了成年小鼠的菌群失调
本文重点研究了HFD 4周后，MS组和MC组肠道菌群变化。MS组共336个OTU, MC组共285个OTU，两组共同拥有269个OTU（图7a）。与HFD前相比，两组中厚壁菌门和变形杆菌门的相对丰度均升高，而拟杆菌门的相对丰度均降低。然而HFD 9周后，MS组变形菌门的丰度比MC组下降得更明显（图7b）。
两组间Shannon和Simpson多样性指数（alpha多样性）无显著差异（图7c）。在beta多样性方面，Adonis分析显示两组之间存在显著差异（图7d）。基于未加权UniFrac距离的3周龄和12周龄子代的PCoA分析显示，HFD确实部分稀释了MS驱动的肠道菌群的差异（图7e）。总之，本文研究结果表明，HFD严重加剧了后代肠道菌群的失调。然而，即使在HFD 4周后，MS组的肠道菌群与MC组仍有部分差异。
图7 母体摄入三氯蔗糖加重12周龄幼鼠肠道发育不良
6、MS使3周龄幼鼠的GPR43表达量降低
有报道称，丁酸盐可激活G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor, GPCRs)，包括在肠上皮细胞和脂肪细胞上表达的GPR41、GPR43和GPR109A。这些GPCRs的激活似乎可以通过多种机制缓解NAFLD的进展。通过免疫组织化学方法检测3周龄子代结肠中GPR41、GPR43和GPR109A的表达发现，在MS组和MC组中，GPR41、GPR43和GPR109A均在结肠组织中表达。然而，MS组结肠中GPR43的表达明显低于MC组，并伴有产丁酸盐细菌和丁酸盐的减少（图8a）。Real-time-PCR数据也显示，3周龄子代结肠组织中GPR43的相对表达量较MC组下降（图8b）。
7、丁酸梭菌通过体外激活GPR43降低炎性细胞因子的产生
与对照组相比，丁酸盐和丁酸梭菌上清液刺激HCT116细胞后，GPR43 mRNA水平分别上调2.2倍和2.8倍，GPR109A mRNA水平分别上调2.9倍和2.1倍，但GPR41 mRNA表达无明显变化。同时，丁酸梭菌上清液和丁酸盐分别使TNF-α的表达下降26.3%和36.1%。此外，通过RNA干扰技术研究了丁酸梭菌的抗炎功能是否依赖于GPR43。沉默GPR43抑制了丁酸梭菌介导的TNF-α 表达量下调。在HCT8细胞中也出现了类似的结果（图8c-g）。这些结果表明，丁酸梭菌通过激活GPR43具有抗炎作用。
图8 丁酸梭菌通过激活GPR43降低炎性细胞因子的产生
研究结论
1
MS抑制3周龄幼鼠的肠道发育，破坏肠道屏障，导致肠道轻度炎症。
2
MS对3周龄幼鼠肠道的微生物组成有显著影响，且HFD可显著加重成年小鼠的菌群失调。
3
MS干扰成年小鼠的脂肪代谢，加重了HFD诱导的肝脂肪变性。
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